骨质疏松症是以骨量减少，骨结构改变，骨脆性增加甚至骨折为特征的疾病。该病常见于老年人群，目前已被世界卫生组织(WHO)称为“无声无息的流行病”。在成骨细胞和破骨细胞维持的骨代谢平衡中，成骨细胞具有非常重要的作用，目前应用的经典抗骨质疏松药物多为抑制破骨细胞活性的药物，但价格昂贵，而且都具有明显的不良反应。因此，更应注重天然植物化合物的开发应用。骨质疏松症的发病机制主要与骨形成和骨吸收动态平衡被破坏、骨形成落后于骨吸收有关[1-2]。而IL-6 在骨代谢旁分泌调节中居重要地位，其参与介导雌激素下降所致的骨吸收加强，在绝经后骨质疏松症发病机制的研究中被认为发挥了重要作用[3]，IL-6的主要作用是诱导破骨细胞生成和活化，可以直接加强破骨细胞的活性，抑制其凋亡并延长破骨细胞的寿命[4]。实验研究证实绝经后骨质疏松症患者IL-6 显著增加，其机制可能是绝经后E2下降，对PTH 的抑制减弱，PTH 与成骨细胞上的PTH 受体结合，刺激成骨细胞大量产生和释放IL-6，从而增强骨吸收，最终导致骨质疏松症的出现。连翘酯苷A 是连翘的主要有效成分之一，是迄今为止从连翘属植物中发现的抗氧化、抗菌活性最强的成分之一，属于连翘提取物中苯乙醇苷类[5]，既往研究发现连翘酯苷对IL-6 有一定的调控作用，可降低血清IL-6 含量。鉴于以上理论基础，连翘酯苷可能与抗骨质疏松有一定相关性。

资料与方法

实验材料：①实验细胞：小鼠MC3T3-E1 成骨细胞株。②主要试剂：MTT 试剂盒，连翘酯苷A(纯度＞98%)；③主要仪器：可见分光光度计。

实验方法：①小鼠胚胎MC3T3-E1成骨细胞株培养：小鼠胚胎MC3T3-E1成骨细胞株采用培养液在37℃，5%CO2培养箱中培养，融合度为80%～90%时传代。②连翘酯苷A 对成骨细胞增殖影响的初步测定(MTT 法)：调整细胞密度为1×10/mL，接种于96 孔板，每孔100 L，24 h 后换含不同浓度连翘酯苷A(0、0.012 5、0.25、25、50和100μmol/L)的DMEM 培养液，其中浓度的连翘酯苷A 为对照组，其余浓度的连翘酯苷A 作为连翘酯苷A 组，每个浓度下设6 个重复孔，孵育24 h。于细胞培养终止前每孔加入MTT(5 g/L)40 μL，继续孵育4 h。吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150 L，振荡10 min，在490 nm 波长处检测各孔吸光度(OD 值)。③矿化结节形成的观察：细胞传代后按每孔5×105个细胞接种于24 孔板内，第2 天更换含药物血清的培养液，以后每2 d 更换培养液1次，连续观察14 d，可见大量的矿化结节形成。吸去培养液，PBS冲洗，95%酒精固定10 min，PBS洗涤2次，加入0.1%茜素红染色液30 min 后在LEICA 光镜下观察，并以红染，边界清晰，短径＞100 Lm 的标准，40 倍光镜下对整个孔计数。以MTT 法测量连翘酯苷A 对小鼠成骨细胞株增殖的影响，采用上述方法观察连翘酯苷A 组和对照组LEICA光镜下0.1%茜素红染色结果，对比两组矿化结晶平均值。④连翘酯苷A作用于小鼠胚胎成骨细胞株：取指数生长期细胞，配制4×104个/mL 的 细胞悬液，取200 μL 接种于96 孔板中，细胞贴壁后，吸去上清，对照组细胞加入20 μL 新鲜培养液。其余实验组分为6 组，分别给予不同浓度(0.25、5、25、75、100、125μmol/L)连翘酯苷A，继续培养24 h。⑤MTT 实验：每孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，继续培养4 h 后终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490 nm 处测量各孔的吸光值，每组重复4次。求其平均值，对两组测定值进行统计分析。

统计学方法：数据采用SPSS 19.0 统计学软件分析；计量资料以(±s)表示，正态性检验选用K-S 检验，方差齐性检验选用Levene检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

茜素红染色法结果：0.1%茜素红染色结果显示，连翘酯苷A 组镜下可见矿化结晶为(12. 4)mM，较对照组(7. 8)mM明显增多，差异有统计学意义(t=6.478，P＜0.05)。见图1。

图1 两组镜下矿化结晶图(茜素红染色法)

图2 两组成骨细胞荧光染色图比较

表1 MTT法测定小鼠胚胎成骨细胞增殖影响初步测定项目 对照组 连翘酯苷A组0.012 5 μmol/L 0.25 μmol/L 25 μmol/L 50 μmol/L 100 μmol/L吸光度 0.639 0.680 0.699 0.696 0.839 2.125 0.638 0.797 0.712 0.721 0.797 2.259 0.644 0.650 0.680 0.715 0.810 2.260 0.642 0.673 0.701 0.704 0.812 2.168均值 0.641 0.675 0.698 0.709 0.815 2.212标准差 0.003 0.019 5 0.013 0.011 0.018 0.078

表2 MTT法测定小鼠胚胎成骨细胞增殖程度项目 对照组 实验组0.25μmol/L 5μmol/L 25μmol/L 75μmol/L 100μmol/L 125μmol/L吸光度 0.636 0.697 0.827 1.258 1.768 2.122 2.213 0.645 0.710 0.783 1.321 1.696 2.233 2.197 0.638 0.678 0.792 1.298 1.735 2.212 2.201 0.641 0.698 0.813 1.317 1.746 2.182 2.132均值 0.640 0.696 0.804 1.299 1.736 2.187 2.186标准差 0.004 0.013 0.020 0.029 0.030 0.048 0.036

文章来源：《云南中医中药杂志》 网址: http://www.ynzyzyzz.cn/qikandaodu/2021/0223/628.html