骨质疏松症(osteoporosis，OP)可造成骨折及骨折并发症引起的残疾甚至死亡，骨质疏松的防治已成为老年人健康的重大课题。近年来，中药治疗骨质疏松症得到广泛认可。续苓健骨方是以中医药理论遣方用药形成的治疗OP的经验方。前期的动物实验表明，续苓健骨方可提高骨质疏松模型大鼠的骨密度[1]，改善骨生物力学性能[2]，提升血钙含量，降低血磷含量[3]，并对其机制进行了一定探索[4-5]。miRNA参与了骨的生长、发育、代谢及药物治疗等各个过程[6-7]。本研究采用二代测序方法，对骨质疏松大鼠模型在续苓健骨方治疗后进行腰椎miRNA测序，探讨小分子非编码RNA在治疗过程中的变化，为临床应用该方治疗OP提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：6月龄SPF级SD雌性大鼠18只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK(沪)2007-0005，合格证编号：2。饲养于福建省中医药科学院比较医学实验中心，实验动物许可证：SYXK(闽)2016-0005。

1.1.2实验药物与试剂：续苓健骨方(国家发明专利号ZL2.4)由川续断、白术、陈皮、赤芍、红花、甘草等12味中药组成，共122 g/剂。中药饮片购自福建省医药公司，按传统中药煎熬方法，每剂取汁 81.33 mL，生药含量为1.5 g/mL，4 ℃冰箱保存备用。大鼠灌胃量计算方法：按成人50 kg：122/50=2.44 g/(kg·d)，大鼠灌胃量：2.44×6.25倍=15 g/kg。

文库构建、测序相关试剂：NEB Next?Poly(A) mRNA 磁性分离模块、NEB Multiplex Small RNA Library Prep Set(美国New England Biolabs公司)；RiboZero Magnetic Gold Kit (Human/Mouse/Rat) (美国Epicentre公司)；TruSeq Rapid SR Cluster Kit (#GD-402-4001，美国Illumina公司)。

1.1.3仪器：Discovery W 双能 X 线骨密度仪(变异系数1.0 CV%，精度0.25%，美国Hologic 公司)；NanoDrop ND-1000(美国Thermal Scientific公司)；生物芯片分析系统Agilent 2100 Bioanalyzer(美国Agilent公司)；Illumina NextSeq 500 测序仪(美国Illumina公司)。

1.2 方法

1.2.1动物分组、造模及给药：大鼠按随机数字表分成3组：假手术组、模型组及续苓健骨方组，每组6只。根据参考文献[1]造模。术后 30 d 开始灌胃给药，续苓健骨方 15 g/kg，上午灌胃；假手术组和模型组给予生理盐水 15 g/kg，连续给药12周。各组动物均普通饲料饲养，自由饮水和活动。

1.2.2取材：最后一次灌胃完成2 h后，以10%水合氯醛麻醉后，取左侧胫骨和第一、二腰椎。胫骨用于骨密度检测；每组随机选3只大鼠腰椎用于提取RNA及测序。

1.2.3骨密度检测：采用双能X线骨密度仪测定各组大鼠左侧胫骨骨密度，操作过程严格按仪器使用说明进行。

1.2.4样品RNA提取及质检：从大鼠第一腰椎提取总 RNA，Nanodrop ND-1000测定RNA 260/280的浓度及蛋白质污染情况，采用变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性。

1.2.5文库构建及测序：构建好文库，用Agilent 2100 Bioanalyzer进行文库质量测定，混合好的不同样品的测序文库，通过0.1 M NaOH变性生成单链DNA，然后在Illumina NextSeq 500测序仪上进行51循环测序。文库构建及测序均委托上海康成生物工程有限公司完成。

1.2.6测序数据分析：采用 miRDeep2 0.0.8 reads 软件把trimmed miRNA 进行已知 miRNA定量和新miRNA预测。使用R软件edgeR 3.18.1进行差异表达计算，筛选差异miRNAs，在线VENNY2.1分析共同差异miRNAs。利用miRNA靶基因数据库统计top10差异miRNA的靶基因，并进行靶基因GO功能显著性富集分析、靶基因Pathway显著性富集分析。

1.3 统计学方法

使用edgeR筛选差异表达miRNA时，设定阈值为1.5倍差异，P<0.05且组内CPM均值≥1。采用 SPSS 17.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示，根据数据是否正态分布，选择非参数检验或t检验比较组间差异，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠胫骨骨密度比较

与假手术组相比，模型组大鼠骨密度显著下降(P<0.01)；续苓健骨方组骨密度较模型组显著提高(P<0.01)；续苓健骨方组与假手术组相比无显著性差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠胫骨骨密度值比较Table 1 Comparison of bone mineral density of tibia between each group (g/cm2,组别例数骨密度假手术组 60.模型组 60.?续苓健骨方组60.?注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，?P<0.01。

2.2 miRNA表达谱组间差异分析

各组之间差异miRNAs数见表2。VENNY 2.1在线进一步分析模型组与假手术组的差异表达基因在续苓健骨方组中表达情况。模型组表达上调，在续苓健骨方组表达下调的miRNAs有50条；模型组表达下调，在续苓健骨方组表达上调的miRNAs有60条，即模型组共有110条异常表达的miRNAs在续苓健骨方组得到纠正。表3列出了这110条差异miRNAs中，续苓健骨方治疗之后上调或下调的top 10 miRNAs，它们在假手术组、模型组、续苓健骨方组的表达变化及其已知功能。

文章来源：《云南中医中药杂志》 网址: http://www.ynzyzyzz.cn/qikandaodu/2021/0305/649.html